بررسي اثرات حذف ژن Fam83h به روش كريسپركس بر فنوتيپ دنداني و بيان ژن هاي موثر در تكامل دندان در موش NMRI

دانشگاه علوم پزشكي كردستان

پزشكي

چكيده : مقدمه ژن Fam83h پروتئين غير ترشحي به همين نام توليد مي¬كند و پيش¬بيني مي¬شود كه نقش ساختاري مهمي در كلسيفيكاسيون ميناي دنداني داشته باشد. در اين مطالعه از روش CRISPR-CAS9 براي بررسي اثر حذف ژن Fam83h در مدل موشي بر فنوتيپ دنداني استفاده شد. مواد و روشها براي هدف قرار دادن ژن Fam83h در موش NMRI سيستم CRISPR/Cas9 مورد استفاده قرار گرفت. در ابتدا مخلوطي از sgRNA ها را همراه با RNA پيام بر (mRNA) سازنده آنزيم اندونوكلئاز نيكازCas9 (D10A) با روش ريز تزريق به پيش هسته و/يا سيتوپلاسم زيگوت دو پيش هسته¬اي موش تزريق شد. پس از به دنيا آمدن موش¬¬ها، براي بررسي تغييرات ژنومي تعيين توالي (Sequencing)، جهت بررسي در سطح mRNA از روش RT-PCR و براي بررسي در سطح پروتئين وسترن بلات(Western blot) انجام گرفت. براي بررسي تغييرات بافت شناسي، بافت دنداني موش¬هاي ناك اوت در مقايسه با موش طبيعي مورد بررسي قرار گرفت. در ادامه بيان ژن¬هاي متالو پروتئاز دنداني( DMP1)، ماتريكس متالوپروتئاز (MMP20)، دنتوسيالو پروتئين(DSP)، آميلوبلاستين (AMBN)، سيگنال پپتيتد پپتيداز2 آ (SSPL2A)، خانواده ژني با تشابه توالي20 آ (FAM20A) ، كازيين كيناز آلفا (CK1a)، كازييين كيناز اپسيلون(CK1e)، پروتتين اصلي ميناي دنداني (ENAM) و فاكتور رشد فيبروبلاستي 10(FGF10) كه در مسير مينراليزاسيون دنداني نقش دارند در موش ناك اوت و طبيعي در بافت دنداني در سنين 5 ، 11 و 18 روز پس از تولد بررسي گرديد. يافته ها موش¬هاي مدل ناك اوت ژنFam83h داراي فنوتيپ پوشش ژوليده،موي كم پشت بهم ريخته، اندازه كوچك بدن و تاخير در فرايند باز شدن چشم در نوزادان اين موش¬ها بودند كه به صورت اتوزوم مغلوب به توارث مي-رسيدند. بررسي¬هاي بافت شناسي فك پايين، دندان نيش پايين و هم¬چنين دندان¬هاي آسياي فك پايين براي موش¬هاي هموزيگوت ناك¬اوت در مقايسه با موش¬هاي طبيعي تفاوت نداشت. پس از 4 نسل بك كراس (back cross) و اينبريدينگ (inbreeding) موش¬هاي ناك اوت، سه سر از موش¬ها داراي نقص در تشكيل دندان بودند. اين موش¬ها تغيير در فنوتيپ دنداني را به شكل تغير رنگ و استعداد شكنندگي و خرد شوندگي بافت دنداني نشان دادند. بررسي¬هاي بيان ژن در بافت دنداني در روزهاي 5، 11 و 18 پس از تولد كاهش بيان معني دار در ژن هايDSP ، FGF10 و AMBN وMMP20 را نشان مي¬داد كه در تشكيل مينا دندان و كاني سازي (Mineralization) نقش دارند(Pv<0.05). بيان ژن Fam20A درگير در تنظيم كاني سازي و همچنين بيان ژن SSPL2A و ENAM در روزهاي 5 ، 11 و 18 كه در تشكيل ميناي دندان نقش دارند تغيير معني داري را نشان ندادند(Pv>0.05). ژن¬هاي مسير Wntشامل CK1a , CK1e b-CAT; كاهش معني داري را در بافت دنداني در روز هاي 5 ، 11 و 18 پس از تولد نشان دادند (Pv<0.05) اما كاهش b-CAT در آستانه سطح معني داري بود(Pv=0.049). بيان ژن FGF10 نيز در بافت دنداني در روز هاي 5 ، 11 و 18 پس از تولد كاهش شديد و معني دار داشت (Pv<0.05). نتيجه گيري: از يافته¬هاي اين مطالعه مي¬توان نتيجه گرفت كه حذف ژن Fam83h در موش با فنوتيپ¬هاي بحث برانگيز در بافت دنداني مرتبط است به شكلي كه نقص ژنFam83h در موش با فنوتيپ نقص دنداني مرتبط است اما احتمالا به شكل يك فنوتيپ تك ژني رفتار نكرده و با اثر بر بيان ژن هاي موثر در كاني سازي دنداني و مسير Wnt در ايجاد فنوتيپ دنداني در موش نقش ايفا مي¬كند. همچنين، بيان ژن¬هاي موثر در مسير كاني سازي به صورت مقايسه¬اي در موش طبيعي و ناك اوت مقايسه شد و نشان داده شد كه نقص اين ژن باعث كاهش بيان ژن¬هاي DSP ، FGF10، AMBN، MMP20 و DMPL مي¬شود. اما بروي بيان ژن Fam20A و ENAM كه پروتئين عمده ميناي دنداني است، تاثير معني دار نداشته است. همچنين، نقش اين ژن بر بيان برخي ژن¬هاي مسير تكاملي Wntدر بافت دندان بررسي شد و مشخص شد كه نقص ژن Fam83h باعث كاهش مسير Wnt در موش مي¬گردد واحتمالا از اين طريق بركاهش بيان ژنهاي موثر بر كاني سازي دنداني نيز موثر است. آنچه از انجام اين مطالعه مي¬توان نتيجه گرفت اين است كه حذف كامل ژن Fam83h در موش نمي¬تواند همانند يك صفت تك ژني عمل كند و فنوتيپ نقص دنداني ايجاد كند اما مي¬تواند باعث كاهش مسير پيام رساني Wnt و كاهش بيان برخي ژن هاي موثر در مسير كاني سازي دنداني گردد. كلمات كليدي: خانواده با توالي هاي مشابه 83H - سيستم كريسپر كس 9- مسير تكاملي Wnt آميلوژنز ايمپرفكتا، نوع هيپوكلسيفيكاسيون ، با توارث اوتوزوم غالب كازئين كيناز 1- كاني سازي

81212

دانشگاه علوم پزشكي كردستان

پزشكي

پزشكي

دانشگاه علوم پزشکي کردستان

فردين فتحي، بهرام نيكخو