بررسي اثر نانوذره دي اكسيد تيتانيوم بر توليد سيليمارين و بيان برخي ژن هاي مسير بيوسنتز آن در كشت سوسپانسيون سلولي خار مريم (Silybum marianum)

اصفهان : دانشگاه صنعتي اصفهان

بيوتكنولوژي كشاورزي

كارشناسي ارشد

خارمريم (Silybum marianum) يكي از گياهان دارويي مهم است كه به دليل توليد تركيبات زيست‌فعال ارزشمندي از جمله سيليمارين، مورد توجه قرار گرفته است. سيليمارين مجموعه‌اي از تركيبات فلاونوليگناني است كه توليد آن تحت تأثير شرايط محيطي و فيزيولوژيك گياه قرار دارد. استفاده از روش‌هاي كشت درون‌شيشه‌اي مي‌تواند زمينه مناسبي براي مطالعه و توليد اين تركيبات را فراهم كند. در اين پژوهش، توسعه و بهينه‌سازي سامانه‌هاي كشت درون‌شيشه‌اي شامل كشت ريشه مويين و كشت سوسپانسيون سلولي خارمريم و بررسي پاسخ كشت سوسپانسيون سلولي به نانوذرات دي‌اكسيد تيتانيوم (TiO₂) مورد مطالعه قرار گرفت. بررسي عوامل مؤثر بر القاي ريشه مويين نشان داد كه موفقيت فرايند تراريخت‌سازي به عواملي مانند سويه Agrobacterium rhizogenes، نوع و سن ريزنمونه و شرايط تلقيح وابسته است. سويه A4 و ريزنمونه دمبرگ بيشترين كارايي را در القاي ريشه مويين نشان دادند و ريزنمونه‌هاي جوان 14 روزه نيز در مقايسه با ريزنمونه‌هاي مسن‌تر پاسخ مطلوب‌تري داشتند. همچنين، چگالي نوري 6/0 تا 8/0، روش تلقيح غوطه‌وري در سوسپانسيون باكتري، مدت تلقيح 10 دقيقه و مدت هم‌كشتي 48 ساعت به‌عنوان شرايط مناسب براي افزايش ريشه‌دهي و كاهش آلودگي انتخاب شدند. افزودن ال-گلوتامين تأثير معني‌داري بر افزايش كارايي القاي ريشه مويين نداشت. بررسي مولكولي ريشه‌هاي القاشده با استفاده از PCR، انتقال موفق ژن rolC و در نتيجه، تراريختگي ريشه‌هاي مويين را تأييد كرد. نتايج بررسي عوامل مؤثر بر كشت سوسپانسيون سلولي نشان داد كه در ميان تيمارهاي هورموني، تركيب 5/1 ميلي‌گرم بر ليتر NAA و 1 ميلي‌گرم بر ليتر BAP مناسب‌ترين پاسخ را از نظر درصد كالوس‌زايي، مساحت و كيفيت كالوس ايجاد كرد. همچنين، برگ بالغ به دليل توليد كالوس‌هاي متراكم، يكنواخت و با كيفيت مطلوب، به‌عنوان مناسب‌ترين ريزنمونه انتخاب شد. تيمار نانوذرات دي‌اكسيد تيتانيوم در كشت سوسپانسيون سلولي خارمريم موجب تغييرات وابسته به غلظت و زمان در پاسخ‌هاي مولكولي و فيزيولوژيك سلول‌ها شد. افزايش بيان ژن CHI، به‌ويژه در غلظت 25 ميلي‌گرم بر ليتر و زمان 48 ساعت، نشان‌دهنده تحريك مسير بيوسنتز تركيبات فنولي و فلاونوئيدي در پاسخ به القا با TiO₂ بود. همچنين، افزايش توليد ROS با گذشت زمان، به‌ويژه در 72 ساعت، همراه با افزايش بيان ژن APX1، بيانگر تداوم تنش اكسيداتيو و فعال شدن پاسخ آنتي‌اكسيداني در سلول‌ها بود. نتايج حاصل از تجزيه و تحليل HPLC نيز نشان داد كه بيشترين ميزان سيليمارين، حدود 32 ميلي‌گرم بر كيلوگرم وزن خشك، در تيمار 50 ميلي‌گرم بر ليتر TiO₂ پس از 72 ساعت مشاهده شد كه به‌طور معني‌داري بيشتر از ساير تيمارها بود. در نهايت، نتايج اين پژوهش نشان داد كه با بهينه‌سازي شرايط القاي ريشه مويين و استقرار كشت سوسپانسيون سلولي، مي‌توان سامانه‌هاي درون‌شيشه‌اي مناسبي براي مطالعه پاسخ‌هاي فيزيولوژيك، بيوشيميايي و مولكولي خارمريم ايجاد كرد. همچنين، نانوذرات TiO₂ موجب ايجاد پاسخ‌هاي وابسته به غلظت و زمان در كشت سوسپانسيون سلولي شدند. اين يافته‌ها مي‌تواند مبنايي براي مطالعات بيشتر درباره سازوكارهاي تنظيم توليد سيليمارين و پاسخ سلولي خارمريم به نانواليسيتورها باشد.

238301

بيوتكنولوژي كشاورزي

مهندسي كشاورزي

دانشگاه صنعتي اصفهان