اثر جهش‌زايي اتيديوم برومايد بر فعاليت و پايداري آنزيم پروتئاز توليد شده در Bacillus halotalorans C1

اصفهان : دانشگاه صنعتي اصفهان

مهندسي كشاورزي

كارشناسي ارشد

چكيده پروتئازها به‌عنوان يكي از مهم‌ترين گروه‌هاي آنزيمي صنعتي، سهمي حدود 60 درصد از بازار جهاني آنزيم‌ها را به خود اختصاص داده‌اند. قابليت هيدروليز پيوندهاي پپتيدي، كاربردهاي گسترده‌اي را در صنايعي همچون شوينده، داروسازي، غذايي، چرم‌سازي و نساجي براي اين آنزيم‌ها به ارمغان آورده است. با اين وجود، پايداري ناكافي بسياري از پروتئازهاي طبيعي در شرايط سخت فرآيندي نظير دماهاي بالا، سطوح نامطلوب pH و حضور تركيبات شيميايي، چالشي عمده در بهره‌برداري صنعتي از آن‌ها محسوب مي‌شود. هدف از اين مطالعه، بهبود ويژگي‌هاي عملكردي و پايداري پروتئاز از طريق جهش‌زايي شيميايي در سويه‌ي باكتريايي مولد بود. در اين پژوهش، سويه‌ي باكتريايي منتخب از جنس Bacillus halotolerans به عنوان سويه‌ي والد در محيط كشت LB مايع كشت داده شد و به منظور القاي جهش، در معرض غلظت 100 ميكروگرم بر ميلي‌ليتر از اتيديوم برومايد (EtBr) به مدت 120 دقيقه قرار گرفت. پس از تيمار جهش‌زا، كلوني‌هاي حاصل بر روي محيط اسكيم‌ميلك آگار كشت داده شدند و غربالگري اوليه بر اساس شاخص نسبت قطر هاله‌ي هيدروليز به قطر كلوني (H/C) انجام پذيرفت. بر اين اساس، 46 كلوني برتر كه داراي بيشترين فعاليت پروتئازي بودند، انتخاب و در سه گروه A) بالاترين قطر هاله(، B )مقدار متوسط (و T) كمترين قطر هاله( دسته‌بندي شدند. سنجش كمي فعاليت آنزيمي با استفاده از روش استاندارد هيدروليز كازئين و اندازه‌گيري جذب نوري در طول موج 660 نانومتر انجام شد. بر اساس نتايج هفت كلوني برتر شامل A1، A4،A13،T1،A14،A20،T26،T19 شناسايي شد كه فعاليت پروتئازي آن‌ها بين 2 تا 3 برابر بيش از سويه‌ي والد بود. ارزيابي پايداري آنزيمي در شرايط سخت )دماي 95 درجه سانتي‌گراد و 8/5 (pH=نشان داد كه آنزيم توليدشده توسط كلونيA4 با دارا بودن فعاليت U/g 83422، پايداري حرارتي و قليايي بسيار بالاتري را در مقايسه با آنزيم سويه‌ي والد U/g) 33733 (نشان مي‌دهد. به منظور شناسايي تغييرات مولكولي، DNA ژنومي كلوني‌هاي منتخب استخراج و ژن كدكننده‌ي پروتئاز (aprE) با استفاده از تكنيك واكنش زنجيره‌اي پلي‌مراز (PCR) تكثير گرديد. محصولات PCR پس از خالص‌سازي، توالي‌يابي شدند. مقايسه‌ي توالي‌هاي به‌دست‌آمده با توالي مرجع، وقوع جهش‌هاي نقطه‌اي منجر به تغييرات آمينواسيدي را تأييد نمود. در كلونيA4، جايگزيني سيستئين با سرين در موقعيت 168 و جايگزيني آرژنين با ليزين در موقعيت 324 مشاهده شد. همچنين، در كلوني‌هايA20 و T19، تغييرات مشابه و اضافي از جمله جايگزيني سرين با سيستئين و هيستيدين با سرين شناسايي گرديد. به نظر مي‌رسد اين تغييرات آمينواسيدي، به‌ويژه جايگزيني‌هاي مرتبط با سيستئين، از طريق تأثير بر تشكيل پيوندهاي دي‌سولفيدي، نقش مستقيمي در افزايش پايداري ساختاري آنزيم در برابر حرارت ايفا كرده‌اند. به طور كلي، يافته‌هاي اين تحقيق مؤيد آن است كه جهش‌زايي شيميايي با اتيديوم برومايد، روشي كارآمد و مقرون‌به‌صرفه براي ايجاد تنوع ژنتيكي و بهبود عملكرد پروتئازهاي باكتريايي است. نتايج اين مطالعه مي‌تواند در توسعه‌ي سويه‌هاي صنعتي مقاوم و توليد پروتئازهاي پايدار با كارايي بالا در شرايط سخت فرآيندي مورد بهره‌برداري قرار گيرد.

236610

بيوتكنولوژي كشاورزي

مهندسي كشاورزي

دانشگاه صنعتي اصفهان