توليد باكتريايي RNA دو رشته‌اي (dsRNA) اختصاصي ژن استيل كوآ كربوكسيلاز (ACC) در سفيد بالك پنبه (Bemisia tabaci)

اصفهان : دانشگاه صنعتي اصفهان

بيوتكنولوژي كشاورزي

كارشناسي ارشد

سفيدبالك پنبه (Bemisia tabaci) يكي از آفات كليدي محصولات زراعي در سطح جهان محسوب مي‌شود كه به دليل ويژگي‌هاي زيستي خاص از جمله توانايي بالاي تغذيه، ترشح عسلك و انتقال ويروس‌هاي گياهي، خسارت‌هاي گسترده‌اي به سيستم‌هاي كشاورزي وارد مي‌كند. مديريت اين آفت عمدتاً بر پايه مصرف حشره‌كش‌هاي شيميايي استوار است. با اين حال، استفاده مداوم و بي‌رويه از اين تركيبات، نه‌تنها به ظهور جمعيت‌هاي مقاوم منجر شده، بلكه پيامدهاي زيست‌محيطي، تهديد سلامت انسان و آسيب به دشمنان طبيعي حشرات را نيز در پي داشته است. بنابراين، توسعه روش‌هاي جايگزين كه از يك‌سو كارايي مؤثر بر كنترل آفت داشته و از سوي ديگر سازگاري بيشتري با محيط زيست نشان دهند، ضرورتي اجتناب‌ناپذير است. يكي از روش‌هاي نوين در اين زمينه، استفاده از فناوري RNAi و توليد RNA دو رشته‌اي (dsRNA) براي خاموش‌سازي ژن‌هاي حياتي آفت است. در اين مطالعه، ژن استيل‌كوآ كربوكسيلاز (ACC) به‌عنوان هدف انتخاب و قطعه‌اي 488 جفت‌بازي از آن به منظور توليد dsRNA طراحي شد. همچنين يك قطعه 419 جفت‌بازي از ژن GUS باكتريايي به‌عنوان كنترل منفي انتخاب گرديد. اين قطعات در وكتور pL4440 كلون شدند و صحت آن‌ها با PCR و توالي‌يابي تأييد شد. سازه‌ها سپس به باكتري HT115 منتقل گرديدند و كلوني‌هاي نوتركيب با آزمون‌هاي انتخابي و كلوني PCR مورد ارزيابي قرار گرفتند. بيان dsRNA با استفاده از تيمار با IPTG القا شد و استخراج RNA كل نشان داد كه باندهاي مشخص با اندازه‌هاي مورد انتظار براي ACC و GUS تنها در نمونه‌هاي القاشده ظاهر مي‌شوند، در حالي كه در كنترل منفي بدون IPTG مشاهده نشد. براي خالص‌سازيdsRNA دو روش رسوب‌گذاري با ليتيوم كلرايد و تيمار آنزيمي بررسي شد. برخلاف گزارش‌هاي پيشين، روش ليتيوم كلرايد قادر به حذف كامل آلودگي‌ها نبود، درحالي‌كه تيمار آنزيمي خلوص بالاتري ايجاد كرد. غلظت متوسط dsRNA حاصل از اين روش براي قطعه GUS برابر 2/3 ميكروگرم بر ميلي‌ليتر و براي قطعه ACC برابر 8/2 ميكروگرم بر ميلي‌ليتر بود، كه با گزارش‌هاي قبلي همخواني داشت. اين يافته‌ها نشان داد كه سويه باكتريايي HT115 در تركيب با وكتور pL4440، ابزاري مؤثر، ارزان و قابل دسترس براي توليد dsRNA در مقياس آزمايشگاهي محسوب مي‌شود و با توجه به هزينه بالاي سنتز in vitro و محدوديت‌هاي آن، استفاده از سامانه باكتريايي مي‌تواند راهبردي عملي‌تر و پايدارتر براي كاربردهاي گسترده در كشاورزي باشد.

236342

بيوتكنولوژي كشاورزي

مهندسي كشاورزي

دانشگاه صنعتي اصفهان