بررسي اثر آنزيم نوتركيب Cu/Zn-SOD از گياه حرا (Avicennia marina) و كاتالاز در محافظت انجمادي اسپرم بز بوئر

اصفهان : دانشگاه صنعتي اصفهان

مهندسي كشاورزي

كارشناسي ارشد

انجماد اسپرم (مايع مني) به طور گسترده‌اي به عنوان يك روش براي برنامه‌هاي لقاح مصنوعي در مقياس بالا، پيشرفت در برنامه‌هاي انتخاب اسپرم، حفاظت از منابع ژنتيكي در حيوانات مختلف و حفظ باروري در افراد داراي بيماري‌هايي كه باروري آن‌ها به مخاطره مي‌افتد، روش بسيار موثري است. با وجود پيشرفت زياد در تكنولوژي و روش انجماد مايع مني، وجود استرس‌هاي فيزيكي و شيميايي به عنوان ايراد اصلي انجماد مايع مني هنوز وجود دارد. در نتيجه اين استرس‌ها پتانسيل باروري از اسپرم‌هاي ذخيره شده در محيط آزمايشگاهي كاهش مي‌يابد. بالا بودن غلظت راديكال هاي سوپر اكسيد در ايجاد آسيب اكسيداتيو پس از انجماد اسپرم مطرح مي باشد. آنزيم سوپراكسيد ديسموتاز (SOD) يك آنزيم آنتي اكسيدان با قابليت حذف راديكال هاي آزاد اكسيژن مي باشد. پراكسيد هيدروژن از ديگر عوامل مخرب در طي انجماد سلول مي باشد. كاتالاز آنزيمي است كه با تبديل پراكسيد هيدروژن به آب اثر تخريب پذير پراكسيد هيدروژن را كاهش مي دهد. در اين تحقيق به منظور بررسي هريك از شكل نوتركيب دو آنزيم كاتالاز جانوري و SOD ي گياهي استفاده شد. براي تهيه SODسويه مهندسي شده باكتري E. coli كه ژن كد كننده CuZnSOD از گياه حراAmSOD1) )كه قبلا در آن همسانه سازي شده بود كشت داده شد. با القاي باكتري با IPTG توليد پروتئين نوتركيب همراه با His-tag در انتهاي آمينوي پروتئين توليد شد. دليل انتخاب اين SOD، فعاليت بالاي آنزيم و پايداري بالاي آن پس از قرار گرفتن در معرض دما و pH هاي مختلف مي باشد كه در پژوهش قبلي به اثبات رسيد. پس از تاييد توليد پروتئين با SDS-PAGE و خالص سازي آنزيم با استفاده از دو مرحله خالص سازي با كروماتوگرافي تمايلي و دياليز فعاليت آنزيمي در هر مرحله توليد مورد بررسي قرار گرفت. به منظور تعيين غلظت بهينه اين دو آنزيم تاثير غلظت هاي مختلف هريك از اين دو آنزيم بر روي حركت و زنده ماني اسپرم مورد بررسي قرار گرفت. سپس اثر هر يك از آنزيم AmSOD1 و كاتالاز در غلظت بهينه و همچنين مخلوط دو آنزيم بر تحرك و زنده‌ماني اسپرم، پراكسيداسيون ليپيد و ميزان سطح ROS قبل از انجماد و بعد از انجماد و ذوب مورد بررسي قرار گرفت. تحرك و زنده ماني اسپرم در تيمار AmSOD1 و تيمار مخلوط به طور معني‌داري (0.01 ≥ P) نسبت به تيمار شاهد و كاتالاز بالاتر بود. يكپارچگي غشاي اسپرم در تمامي تيمارها نسبت به گروه شاهد به طور معني‌داري (0.01 ≥ P) بهبود پيدا كرد. همه‌ي تيمارهاي موردنظر به طور معني‌داري (0.01 ≥ P) سطح ROS را نسبت به گروه شاهد كاهش دادند. براي سطح پراكسيداسيون ليپيدها تفاوت معني‌داري بين گروه‌هاي مختلف مشاهده ‌نشد. انجماد اسپرم همراه با هر يك از اين دو آنزيم و يا استفاده از دو آنزيم انجام شد و پس از گذشت سه ماه از انجماد مجددا نمونه ها ذوب شدند. فاكتورهاي اشاره شده در بالا مجددا مورد بررسي قرار گرفت. تحرك، زنده ماني و يكپارچگي غشا در اسپرم هاي تيمار شده با AmSOD1 و تركيب هر دو آنزيم به طور معني داري بيشتر از كاتالاز به تنهايي و گروه شاهد بود(0.01 ≥ P). تخريب DNA ، ميزان ROS و پراكسيداسيون لپيد در تمام تيمارها نسبت به شاهد كمتر بود (0.01 ≥ P). با توجه به نتايج به دست آمده به نظر مي رسد AmSOD1 نقش موثري در بهبود حفظ انجمادي اسپرم داشته است. با توجه به تاثير يكسان تركيب دو آنزيم با تاثير AmSOD1 به تنهايي استفاده آنزيم AmSOD1 مقرون به صرفه تر است. با اين حال نتيجه نهايي پس از انجام IVF بايد به طور نهايي مورد بررسي قرار گيرد.

232007

بيوتكنولوژي

مهندسي كشاورزي

دانشگاه صنعتي اصفهان