تجمع زيستي آرسنيك در باكتري سودوموناس پوتيدا از طريق انتقال ژن كد كننده ArsR1 از باكتري كورينه باكتريوم گلوتاميكوم

اصفهان : دانشگاه صنعتي اصفهان

بيوتكنولوژي كشاورزي

كارشناسي ارشد

آرسنيك يكي از سميترين عناصر جهان محسوب ميشود. با اين حال امروزه در زنجيرهي غذايي انسانها و جانوران نفوذ كردهاستوخطراتجبرانناپذيريبرايسلامتآنهاپديدآوردهاست. شناساييكلاتهكنندههايپروتئينيياغيرپروتئيني در موجودات از اهميت زيادي برخوردار است. ميكروارگانيسمها استراتژيهاي مختلفي براي مقابله با آرسنيك ايجاد كردهاند. وجود اپرون ars پلاسميدي و كروموزومي يكي از مهمترين مكانيسمها براي سمزدايي آرسنيك در باكتريها است. ArsR يك پروتئين تنظيم كننده است و به عنوان بازدارنده اپرون ars عمل ميكند، بهعلاوه اين پروتئين قابليت اتصال به آرسنيت را نيز دارا ميباشد كه ميتوان با بيشبيان اين پروتئين ميزان جذب آرسنيك توسط باكتري را افزايش داد. در اين تحقيق مهندسي ژنتيك باكتري سودوموناس پوتيدا سويه غير بيماري زا KT2440 به منظور افزايش تجمع آرسنيك در اين باكتري استفاده شد. دليل استفاده از اين باكتري ساپروفيت بودن و در نتيجه امكان زيست آن در زيستگاههاي اكولوژيكي مختلف مانند خاك، زهكشها، آب شيرين و شور مي باشد. اين خصوصيات باعث شد كه به جاي استفاده از باكتري اشريشياكلي از اين باكتري استفاده گردد. لذا ژن كد كننده cgArsR از باكتري كورينه باكتريوم گلوتاميكوم كه قبلا جداسازي شده بود به وكتور بياني مناسب براي سودوموناس پوتيدا يعني پلاسميدpSEVA234 انتقال يابد. براي ساخت اين دستواره از باكتري اشريشاكلي به عنوان ميزبان اول استفاده شد. پس از ساخت دستواره نهايي به سودوموناس پوتيدا انتقال داده شد. پس از القا با IPTG بيان شكل نوتركيب اين دو پروتئين مورد بررسي قرار گرفت. به اين منظور پروتئين كل با استفاده از SDS و پروتئين فاز محلول با استفاده از ليز آنزيمي استخراج شد و بر روي SDS-PAGE ران شدند. باند پروتئين با وزن مولكولي منطبق بر CgArsR بر روي ژل مشاهده شد كه نشان دهنده بيان موفق شكل نوتركيب اين پروتئينها بود. پس از تأييد بيان پروتئين در فاز محلول و افزايش مقاومت سويه مهندسي شده در برابر 4 ميليمولار آرسنيت، تجمع زيستي +As3 متصل به پروتئين ArsR در سلولهاي در حال استراحت در غلظتها و زمانهاي مختلف، pH و غلظتهاي مختلف NaCl مورد بررسي قرار گرفت. انتخاب سلولهاي در حال استراحت به اين دليل بود كه در اين حالت، سلول نياز به مواد مغذيبرايرشدنداردوفقطازنظرمتابوليكيفعالاست. نتايجنشاندادكهباكتريمهندسيشدهعملكردبهتريدرحذف آرسنيك نسبت به سويه شاهد داشت. به طوريكه در غلظت 0/5 ميليمولار آرسنيك در بافر فسفات با pH 7.4 و غلظت صفر NaCl و در زمان ده ساعت، 264/6 ميكروگرم آرسنيت به ازاي هر گرم وزن خشك سلول حذف شد، اين درحالياست كه در سويهي شاهد اين مقدار 136/9 ميكروگرم آرسنيت بر گرم وزن خشك باكتري بود. همچنين با افزايش و ياكاهش غلظت اوليهي آرسنيك ميزان تجمع كاهش يافت درواقع بهترين عملكرد باكتري تا جايي است كه بقاي باكتري تهديد نشود و فعاليت پمپهاي خروج آرسنيك كمتر از عوامل ورود آرسنيك (مانند پروتئين ArsR) به درون سلول باشند. همچنين به منظور اندازهگيري ميزان تجمع آرسنيك در شرايط محيطي مختلف، اين آزمايش در غلظتهاي مختلف NaCl و pH متفاوت انجام شد. باوجود اختلاف بين دو سويهي كنترل و P .ArsR اما بهترين نتيجه در 7 pH و غلظت صفر NaCl مشاهده شد. بالا رفتن تجمع آرسنيك در سودوموناس پوتيدا براي در اين تحقيق و قابليت آن در استفاده براي حذف آرسنيك در حالت استراحت چشم انداز جديدي را براي استفاده از اين باكتري براي زيست پالايي ايجاد مي كند.

229696

بيوتكنولوژي

مهندسي كشاورزي

دانشگاه صنعتي اصفهان