جداسازي باسيلوس سوبتيليس با توان بالقوه پروبيوتيك از فرآورده¬هاي غذايي، مطالعه بيان cagL در سطح اسپور باسيلوس سوبتيليس و ارزيابي ايمني¬زايي آن در تجويز خوراكي به موش BALB/c

دكتري

هليكوباكتر پيلوري، باكتري بيماريزايي است كه در مخاط معده حدود نيمي از جمعيت جهان مستقر شده است. جايگاه cagPAI كدكننده سيستم ترشحي تيپ IV، يكي از عوامل مهم بيماريزايي اين باكتري است كه خطر ابتلا به سرطان معده را افزايش مي¬دهد. پروتئين حفاظت¬شده‌ي CagL بخشي از اين سيستم ترشحي است كه با اتصال و فعال¬سازي گيرنده‌هاي اينتگرين 51 و v5 در سطح سلول‌هاي اپي¬تليال معده نقش مهمي در انتقال عوامل حدت به سلول هدف ايفا مي¬كند. بنابراين استفاده از آن به عنوان واكسن براي ايمن‌سازي نسبت به هليكوباكتر پيلوري مدنظر قرار گرفته است. از طرف ديگر، اسپورهاي باكتريايي با توانايي زنده¬ماني در شرايط سخت محيطي، توجه محققين را به عنوان ابزاري مفيد براي استفاده در تكنيك نمايش در سطح به خود جلب كرده¬اند. بنابراين بررسي نقش احتمالي پروتئين CagL در القاي پاسخ‌هاي ايمني با استفاده از سيستم نمايش در سطح اسپور باسيلوس سوبتيليس هدف اصلي مطالعه حاضر قرار گرفت. در اين مطالعه، پروتئين CagL از هليكوباكتر پيلوري به عنوان پروتئين هدف و پروتئين‌هاي CotG و CotE كه از پروتئين‌هاي پوشش اسپور محسوب مي‌شوند، به عنوان پروتئين الحاقي انتخاب شدند. ساخت ناقل‌هاي pCotE-CagL و pCotG-CagL از ناقل pSDJH100 جهت مهندسي اسپور و سپس انتقال ناقل‌ها به باكتري باسيلوس سوبتيليس DB104 انجام گرفت. اين ناقل حاوي توالي‌هاي همولوگ با كروموزوم باسيلوس سوبتيليس مي‌باشد و طي نوتركيبي، قطعات ژني CotG-CagL و CotE-CagL وارد كروموزوم مي‌شوند. بنابراين، همزمان با بيان پروتئين‌هاي پوشش اسپور، پروتئين هدف نيز در سطح اسپور بيان مي‌شود. بيان ژن كدكننده پروتئين CagL در دو ناقل داراي پروتئين‌هاي پوششي CotG و CotE در سطح اسپور باسيلوس سوبتيليس با استفاده از آنتي‌بادي‌هاي اختصاصي نشاندار با HRP و FITC در روش¬هاي ايمنوبلاتينگ و ميكروسكوپ ايمنوفلورسنس موردارزيابي قرار گرفت. مقدار 200 ماكروليتر از سوسپانسيون معادل 1010 از اسپور باكتري‌هاي نوتركيب حاوي ناقل‌هاي pCotE-CagL و pCotG-CagL و نيز باكتري غيرنوتركيب باسيلوس سوبتيليس DB104 به صورت خوراكي و درفاصله‌هاي زماني مشخص به موش‌هاي BALB/c خورانده شدند و پاسخ ايمني ايجادشده به وسيله آزمون وسترن بلات ارزيابي شد. در اين آزمون، از سرم موش‌هاي گاواژشده با اسپورهاي نوتركيب و غيرنوتركيب به عنوان آنتي‌بادي اوليه استفاده شد. مشاهده¬ي تشكيل باند براي باكتري‌هاي نوتركيب و عدم مشاهده‌ي باند در باكتري غيرنوتركيب، نشان‌دهنده توليد آنتي‌بادي اختصاصي عليه پروتئين CagL در سرم موش‌هاي گاواژشده با اسپورهاي نوتركيب بوده كه تاييدكننده كيفي ايمني¬زايي موش¬ها مي¬باشد. بنابراين نتايج نشان مي¬دهند بيان پروتئين CagL هليكوباكتر پيلوري در سطح اسپور باسيلوس سوبتيليس موفقيت¬آميز بوده و مي¬توان باكتري‌هاي نوتركيب حاصل را به عنوان كانديداي واكسن خوراكي عليه عفونت هليكوباكتر پيلوري معرفي نمود.

229525

دانشگاه اصفهان

جون هيونگ كيم

ميكروبيولوژي

محمد رباني خوراسگاني , افروز السادات حسيني ابري