توليد شكل نوتركيب آنزيم سرين استيل ترانسفراز گياه آفتابگردان در باكتري اشريشياكلي

اصفهان : دانشگاه صنعتي اصفهان

بيوتكنولوژي

كارشناسي ارشد

آمينو‌اسيد سيستئين، يك آمينواسيد مهم حاوي گوگرد ميباشد كه به طور گسترده در صنايع مختلفي از جمله مواد غذايي، كشاورزي، افزودنيهاي خوراكي، دارويي، آرايشي و بهداشتي استفاده ميشود. سيستئين در بسياري از متابوليت هاي حياتي سلول از جمله ساخت تركيبات حاوي سولفور مانند متيونين، تيامين و كوآنزيم-A به كار رفته است. در افزودني هاي خوراك انسان و دام، سيستئين نقش مهمي در افزايش تعديل ايمني حيوان، رشد حيوانات و افزايش توليد پوست و مو دارد. سيستئين به طور دقيق به عنوان يك آمينواسيد ضروري در رژيم غذايي حيوانات در نظر گرفته نمي‌شود؛ زيرا مي تواند از متيونين سنتز شود، اما در وعده هاي غذايي كه متيونين محدود است، سيستئين بسته به شرايط ضروري مي‌شود و لذا ممكن است مصرف اين آمينواسيد نيز مانند ديگر آمينواسيدهاي ضروري شود. به دليل اهميت سيستئين و كاربرد بالاي آن در فرآورده‌هاي دارويي، آرايشي و غذايي توليد آن با استفاده از مهندسي متابوليك در ميكرو‌ب‌ها اهميت زيادي پيدا كرده است. در باكتري‌ها سيستئين از آمينواسيد سرين توليد مي‌شود و در اين مسير ابتدا سرين به او-استيل‌سرين تبديل مي شود و سپس اين ماده حد واسط به سيستئين تبديل مي‌شود. اين دو واكنش به ترتيب توسط دو آنزيم سرين استيل ترانسفرار (SAT) و سيستئين سنتاز كاتاليز مي‌شود. در اين مسير آنزيم SAT آنزيم كليدي است چون اين آنزيم تنظيم كننده مسير مي باشد و با افزايش سيستئين معمولا فعاليت آن مهار مي‌شود. مهار فعاليت آنزيمي SAT در اثر بالا رفتن سيستئين در باكتري‌ها بيشتر گزارش شده و در گياهان كمتر ديده شده است. در اين تحقيق به منظور افزايش سيستئين در باكتري E. coli ژن كد كننده آنزيم SAT از باكتري E. coli به شكل موتاسيون يافته (جايگزيني آمينواسيد متيونين به آمينواسيد آرژنين EcSATm) و ژن كد كننده اين آنزيم از گياه آفتابگردان (HaSAT) سنتز و در وكتور pCDFDuet-1 همسانه سازي شد. وكتور حاصل به باكتري هاي مستعد ساخته شده از باكتري E. coli سويه Rosetta (DE3) انتقال داده شد. پس از القا با IPTG بيان شكل نوتركيب اين دو پروتئين مورد بررسي قرار گرفت. به اين منظور پروتئين كل با استفاده از SDS و پروتئين فاز محلول با استفاده از ليز آنزيمي استخراج شد و بر روي SDS-PAGE ران شدند. باند پروتئين با وزن مولكولي منطبق بر EcSATm و HaSAT بر روي ژل مشاهده شد كه نشان دهنده بيان موفق شكل نوتركيب اين پروتئين‌ها بود. در حاليكه بخش غالب پروتئين EcSATm در فاز محلول باكتري قرار گرفت، بخش قابل توجهي از پروتئئين HaSAT به صورت اجسام متراكم در فاز نامحلول قرار گرفت. مقدار سيستئين در سويه هاي حاصل كه به ترتيب R-EcSATm و R-HaSAT نام گرفت مورد بررسي قرار گرفت. سيستئين يك محصول بيرون سلولي است با اين حال مقدار سيستئين در داخل سلول و خارج سلول اندازه گيري شد. نتايج نشان داد كه بيش بيان اين آنزيم ها در باكتري باعث افزايش معني داري در مقدار سيستئين شده است. با اين حال مقدار سيستئين در محيط كشت خارج سلولي R-EcSATm به طور معني داري بيشتر از R-HaSAT بود؛ اين مقداردر اين سويه به 1572±7.1 ميكروگرم بر ليتر رسيد. با توجه به اينكه سيستئين ممكن است در مسير توليد گلوتاتيون قرار بگيرد مقدار گلوتاتيون هم كه عمدتاً يك محصول داخل سلولي است مورد بررسي قرار‌گرفت. در حاليكه مقدار گلوتاتيون در سويه كنترل 960±23.8 ميكروگرم بر ليتر بود، اين مقدار به ترتيب در دوسويه R-EcSATm و R-HaSAT به 4201±32.4 و 1257±41.89رسيد. با توجه به اينكه افزايش سيستئين و گلوتاتيون مقاومت به تنش ها را افزايش مي دهد اين موضوع با معرض قراردادن سويه هاي نوتركيب جديد در برابر تنش هاي اكسيداتيو و فلزي بررسي شد. نتايج نشان داد كه سويه هاي نوتركيب حاصل و به طور ويژه R-EcSATm مقاومت معني داري نسبت به كنترل نشان داد. نتايج حاصل چشم انداز خوبي براي مهندسي مسير هاي متابوليكي براي افزايش آمينو اسيد سيستئين ايجاد كرد.

229475

كشاورزي

مهندسي كشاورزي

دانشگاه صنعتي اصفهان