راه اندازي روش آناليز منحني ذوب با وضوح بالا جهت شناسايي واريانت هاي رايج ژنتيكي كاهنده فعاليت آنزيم دي هيدروپيريميدين دهيدروژناز

دانشگاه علوم پزشكي كردستان

بيوشيمي

مقدمه و هدف: نقص آنزيم دي هيدروپيريميدين دهيدروژناز يك سندرم فارماكوژنتيكي مرتبط با سميت هاي شديد يا كشنده پس از مصرف 5-فلورويوراسيل و پيش داروهاي خوراكي آن مثلcapecitabine (CAP) است كه به طور گسترده براي درمان تومور هاي مختلف مورد استفاده قرار مي گيرند. پليمورفيسم هاي ژنتيكي در ژن كدكننده اين آنزيم (ژن دي هيدروپيريميدين دهيدروژناز ) ممكن است باعث كاهش يا از دست رفتن فعاليت آنزيم شوند كه اين خود منجر به تجمع دارو و متابوليت هاي آن و سميت هاي بالقوه مرتبط با داروهاي فلوروپيريميديني مي شود. تكنولوژي منحني ذوب با وضوح بالا كه اخيرا توسعه يافته است، يك تكنيك بسيار حساس، پيشرفته، سريع و مقرون به صرفه براي شناسايي جهش هاي تك نوكلئوتيدي است. آناليز HRM مي تواند به كمك Real-time PCR پليمورفيسم هاي متعدد ژن DPYD را از اشكال سالم آن به روشي مستقيم و موثر افتراق دهد. هدف اين مطالعه طراحي يك روش ژنوتايپينگ كاربردي، ساده، سريع و مقرون به صرفه با استفاده از HRM براي شناسايي يكي از واريانت هاي رايج ژنتيكي ژن DPYD c.1236G>A (rs56038477) است. مواد و روش ها: بعد از طراحي پرايمرها و توالي هاي كنترل، ما يك روش HRM به وسيله ي اين توالي ها راه اندازي كرديم. اين توالي هاي كنترلي به صورت توالي هاي سالم و جهش يافته از نظر واريانت c.1236G>A بودند. پس از راه اندازي روش، كارآيي آن را بر روي 24 عدد نمونه خون خشك شده (بعنوان كنترل خارجي) مورد بررسي قرار داديم. همچنين براي بررسي بيشتر تعدادي نمونه كلينيكي مجهول از نظر واريانت مورد بررسي نيز با استفاده از متد طراحي شده آناليز گرديد. پس از آناليز منحني هاي ذوب، نمونه ها از لحاظ وجود ژنوتيپ هاي سالم، هموزيگوت و هتروزيگوت به سه گروه دسته بندي شدند. در فاز آخر پروژه به منظور تائيد دقت و اعتبار روش راه اندازي شده، نتايج حاصل از روش HRM با نتايج حاصل از تعيين توالي مقايسه شد. يافته ها: ژنوتيپ هاي واريانت rs56038477 (GG، AA و GA) به خوبي از هم تفكيك شدند. از ميان نمونه هاي كنترل خارجي مورد بررسي، يك نمونه با ژنوتيپ هتروزيگوت تشخيص داده شد. هيچكدام از نمونه هاي كلينيكي واجد واريانت rs56038477 تشخيص داده نشدند. نتايج آناليز HRM كاملا مطابق با نتايج Sanger sequencing بود. نتيجه گيري: تكنيك HRM راه اندازي شده از حساسيت بالايي براي تشخيص واريانت c.1236G>A برخوردار است. با توجه به كارآرايي بالاي اين روش و همچنين زمان و هزينه پايين لازم براي سنجش، مي توان از آن بعنوان جايگزيني براي روش هاي سنتي تشخيص واريانت هاي ژنتيكي DPYD، به ويژه در كشورهاي با اقتصاد ضعيف، استفاده كرد. كلمات كليدي: دي هيدروپيريميدين دهيدروژناز؛ 5-فلورويوراسيل؛ منحني ذوب با وضوح بالا؛ جهش هاي تك نوكلئوتيدي؛ لكه خون خشك شده

226087

دانشگاه علوم پزشكي كردستان

بيوشيمي

پزشكي

دانشگاه علوم پزشکي کردستان

محمد عبدي