رديابي و تعيين خصوصيات باكتري هاي .Agrobacterium sp از نهالستان هاي درختان ميوه ي هسته دار در اصفهان

اصفهان : دانشگاه صنعتي اصفهان

كشاورزي

كارشناسي ارشد

بيماري گال طوقه يكي از بيماري هاي مهم نهال هاي درختان ميوه مي¬باشد كه توسط گونه هايي از باكتري Agrobacterium spp. متعلق به خانواده ي Rhizobiaceae ايجاد مي¬شود. عامل بيماري در خاك زمستان گذراني مي¬كند و و پس از ورود به گياه از طريق زخم، با القاي رشد خارج از كنترل سلول¬هاي ميزبان (Neoplasia) موجب تشكيل گال در سطح ريشه، طوقه و شاخه¬ها مي¬شود. اين گال¬ها كه ابتدا كوچك، نرم و سفيد هستند، با گذشت زمان بزرگ¬تر، چين خورده و قهوه¬اي رنگ مي¬شوند. با توسعه گال و ايجاد فشار بر سيستم آوندي، انتقال آب و مواد غذايي در گياه كند شده وگياهان مبتلا به گال ضعيف و كم رشد مي¬مانند و ممكن است طي يك مدت طولاني از بين بروند. در كنترل بيولوژيكي بيماري گال طوقه، استفاده از باكتري A. radiobacter K1026 مرسوم است. اين باكتري، باكتريوسيني تحت عنوان اگروسين84 توليد مي-كند كه در كنترل اگروباكتريوم¬هاي نوپالين¬دار موثر است. طي سال¬هاي 1399 تا 1400 در نهالستاني در مباركه اصفهان، براي اولين بار علائم گال طوقه روي بعضي نهال¬هاي هسته¬داران مشاهده شد. به دليل اهميت وقوع بيماري و امكان انتشار بعدي آن به مناطق ديگر از طريق صادرات نهال، اهداف پژوهش حاضر شناسايي باكتري عامل بيماري و تعيين جايگاه تاكسونوميكي آن و همچنين امكان كنترل بيولوژيكي عامل بيماري توسط استرين K1026 تعيين شد. ابتدا از گال¬هاي نه نهال بادام، گوجه سبز و آلوي مبتلا به بيماري و خاك اطراف آن¬ها نمون¬ه برداري شد. پس از جداسازي باكتري از گال و خاك، تمام جدايه¬ها تحت واكنش PCR با جفت آغازگر RGF/RGR،كه در اين پژوهش بر مبناي توالي ژن fliG جنس اگروباكتريوم طراحي شده بود، يك باند حدود 517 نوكلئوتيدي تكثير كردند و به اين ترتيب تمام جدايه¬ها متعلق به Agrobacterium ارزيابي شدند. در انگشت نگاري ژنتيكي با آغازگرهاي BOX1R و ERIC1/ERIC2، جدايه¬هاي به دست آمده از گال در گروه متفاوتي از جدايه¬هاي خاك قرار گرفتند. جدايه¬هاي گال نهال¬ها درگياهان شمعداني، گوجه فرنگي، فلفل و نيز برش¬هاي هويج بيماريزا بودند، ولي جدايه¬هاي خاك غير بيماريزا تشخيص داده شدند. با استفاده از آزمون¬هاي بيوشيميايي، تعلق تمام اين جدايه¬ها به A. tumefaciens biovar1 تأييد شد. در مطالعات مولكولي، با كاربرد جفت آغازگرهاي طراحي شده از توالي نواحي ژني دخيل در بيماريزايي مانند VCF/VCR، ʹVirD2A/VieD2C و tms2A/tms2B طي واكنش PCR، در اين جدايه¬ها تك باندهاي نوكلئوتيدي با اندازه¬هاي مورد انتظار تكثير شد، ولي جدايه¬هاي خاك چنين باندهايي توليد نكردند و به اين ترتيب، بيماريزايي جدايه¬هاي گال و عدم بيماريزايي جدايه¬هاي خاك اثبات گرديد. همچنين، تكثير قطعات 206 و 246 نوكلئوتيدي در واكنش PCR، به ترتيب با جفت آغازگرهاي RBF/RBR و F14/F44 مشخص نمود كه جدايه¬هاي بيماريزاي اين پژوهش نوپالين¬دار هستند. اگرچه كاربرد جفت آغازگرهاي توصيه شده براي تعيين نوع ژنوموار موفقيت آميز نبود، ولي با ترسيم درخت فيلوژني بر اساس جفت آغازگرهاي مبتني بر ژن¬هاي housekeeping، معلوم شد كه جدايه¬هاي اگروباكتريومي از نهال، به ژنوموار1 (A. fabacearum) و جدايه¬هاي خاك به ژنوموار2 [A. (Rhizobium) pusense] شباهت دارند. براي بررسي امكان كنترل بيولوژيكي جدايه¬هاي بيماريزاي اين پژوهش با استرين K1026، طي تلقيح همزمان و يا تلقيح اوليه با K1026 و پس از 48 ساعت با جدايه¬ي بيماريزا روي محيط كشت و ديسك¬هاي هويج (in vitro) و گياهان گوجه فرنگي و فلفل درگلخانه (in vivo) ، نتايج مناسبي به دست نيامد. ظهور هاله¬ي شفاف ممانعت از رشد جدايه¬هاي بيماريزا در اطراف محل تلقيح استرين K1026 در 24 ساعت اوليه، رشد باكتري در همان ناحيه پس از 48 ساعت و شفاف شدن مجدد در پنج روز بعدي موجب ترديد در موفقيت اين كنترل بيولوژيكي شد. در آزمايشات مكرر گلخانه¬اي نيز در محل تلقيح گياهان گال تشكيل گرديد و به اين ترتيب كنترل با موفقيت همراه نبود. به منظور بررسي امكان شناسايي استرين¬هاي توليد كننده¬ي اگروسين در جدايه¬هاي بدست آمده از خاك، از توالي ژن agnF مستقر در پلاسميد pAgK84 باكتري A. radiobacter K1026 دو جفت آغازگر طراحي گرديد كه در آزمون PCR، باندهاي مورد انتظار در آن¬ها و همچنين استرين K1026 تكثير نيافت و هدف مورد نظر محقق نشد. به نظر مي¬رسد امكان كنترل بيولوژيكي گال طوقه در نهال¬هاي هسته¬دار و همچنين طراحي آغازگر براي شناسايي استرين¬هاي توليد كننده اگروسين به بررسي¬هاي بيشتري نياز دارد.

219063

بيماري شناسي گياهي

مهندسي كشاورزي

دانشگاه صنعتي اصفهان