بررسي روشهاي انتقال موقت ژن پلاسمينوژن انساني (t-PA) بر بيان آن در گياه توتون (.Nicotiana tabacum L)

اصفهان : دانشگاه صنعتي اصفهان

كشاورزي

كارشناسي ارشد

در طول چندين سال گذشته، به دليل وجود ويژگي‌هاي منحصر به فرد سيستم‌هاي بياني مبتني بر گياه از قبيل، توليد بيشتر در مدت زمان كمتر، عدم وجود پاتوژن‌هاي انساني يا سموم و هزينه كمتر نسبت به ساير سيستم‌ها، توجه داشمندان به سمت توسعه گياهان تراريخته در زمينه توليد پروتئين دارويي در مقياس بزرگ جلب شده است. يكي از مهم‌ترين پروتئين‌هاي دارويي در تجزيه لخته‌هاي خون در قسمت‌هاي مختلف بدن، فعال كننده پلاسمينوژن نوع بافتي انساني(t-PA) است. هدف از انجام پژوهش حاضر، بررسي ميزان بيان ژن t-PA در دو روش متفاوت انتقال موقت و در سه بازه زماني 5، 7 و 9 روز مي‌باشد. در اين پژوهش، سازه حاوي ژن t-PA در آگروباكتريوم با استفاده از آزمون colony PCR تاييد گرديد، سپس ژن مورد نظر به دو روش متفاوت به گياه توتون منتقل شد. در روش اول با استفاده از يك سرنگ بدون سوزن مايه‌ي تلقيح به سطح زيرين برگ تزريق شد و در روش دوم سطح برگ به وسيله‌ي سوزن خراشيده شد و گوش پاك كن آغشته به مايه‌ي تلقيح بر سطح خراش كشيده شد. در نهايت نتايج آناليز گياهان تراريخت در دو سطح RNA و پروتئين بررسي گرديد. از برگ‌هاي گياهان تراريخت استخراج RNA صورت گرفت و cDNA سنتز شد سپس cDNA سنتز شده، براي آزمون RT-PCR مورد استفاده قرار گرفت. همچنين در سطح پروتئين، از برگ گياه توتون تراريخت، پروتئين كل استخراج گرديد و آزمون SDS-PAGE انجام شد. آناليز داده‌هاي حاصل از آزمون RT-PCR نشان داد در روش تزريق ميزان بيان ژن در روزهاي متفاوت با يكديگر اختلاف معني داري دارند ولي در خراش اين اختلاف معني دار نيست. در روش تزريق بيشترين ميزان بيان ژن در روز پنجم پس از تلقيح به دست آمد ولي در روش خراش در هر سه بازه زماني ميزان بيان ژن هدف بسيار اندك بود. در بررسي الگوهاي باندي الكتروفورزي پروتئين تفاوت مشهودي از نظر وجود باند اضافي در نمونه‌هاي برگ‌هاي تزريق شده با آگروباكتريوم حاوي ناقل نسبت به برگ‌هاي شاهد مشاهده نشد. وجود مقدار اندك پروتئين و عدم بهينه‌سازي كدون‌هاي ژن مذكور براي بيان در سيستم يوكاريوتي مي‌تواند دليل بر اندك بودن مقدار پروتئين توليد شده باشد. روش آگرواينفيلتراسيون در روزهاي متفاوت ميزان بيان ژن هدف بيشتري را نسبت به خراش سطح برگ داشت، بنابراين مي‌توان نتيجه گيري كرد كه انتقال ژن به روش آگرواينفيلتراسيون مناسب‌تر است و ميزان بيان ژن هدف در اين روش بيشتر مي‌باشد. به طور كلي، مي‌توان نتيجه گرفت كه نوع روش انتقال بر ميزان بيان ژن تاثيرگذار است، لذا انتخاب بهترين روش انتقال باعث افزايش ميزان بيان ژن هدف در گياه مي‌شود كه مي‌تواند پروتئين دارويي مورد نياز را باصرف هزينه كمتر در مقياس وسيع در اختيار بيماران قرار دهد.

218553

بيوتكنولوژي

مهندسي كشاورزي

دانشگاه صنعتي اصفهان