بررسي نقش ژن هموكسي ژناز 1 از طريق القا با hemin و خاموش كردن (ناك اوت) آن با فناوري CRISPR/CAS9 در كاهش يا افزايش تكثير سلولي ، آپوپتوز، تهاجم سلولي و ميزان حساسيت آنها به سيس پلاتين در رده هاي سلولي سرطان سينه در محيط برون تن.

رشت

مقدمه:. سرطان پستان يكي از شايع ترين سرطان هاست و مرگ و مير ناشي از اين بيماري آمار قابل ملاحظه اي دارد.روش هاي زيادي از جمله راديوتراپي، شيمي درماني و جراحي براي درمان اين بيماري انجام مي شوند كه علاوه بر اين كه درمان هاي قطعي نيستند،عوارض جانبي زيادي هم دارند.بنابراين لزوم روش درماني قطعي تر با عوارض كمتر به شدت در درمان اين بيماري احساس مي شود. ژن هاي زيادي در سرطان دخيل هستند كه يكي از اين ژن ها ژن هموكسي ژناز 1 است كه آنزيمي القايي است كه ميزان بيان آن در وضعيت فيزيولوژيك نرمال سلول بسيار ناچيز است. ولي در شرايط استرس زا مثل بالابودن استرس اكسيداتيو كه در بيماري هايي مانند سرطان اتفاق مي افتد بيان آن به ميزان قابل توجهي افزايش مي يابد و محيط مناسبي را براي رشد سلول هاي سرطاني فراهم مي كند. اين آنزيم علاوه بر افزايش مقاومت سلول هاي سرطاني نسبت به درمان، باعث افزايش تهاجم و تكثير نيز مي گردد. بنابراين، در اين مطالعه با استفاده از همين از يك سو بيان هم اكسي ژناز را در رده ي سلوليT47D القا كرديم و از سوي ديگربا استفاده از فناوريCRISPR/CAS9 ، اين ژن را ناك اوت كرديم و در ادامه ميزان آپوپتوز، تهاجم سلولي و تكثيرسلولي را در اين سلول هاي بررسي كرديم همچنين در ادامه كار ميزان حساسيت سلول هاي تيمارشده با همين و سلول هاي ناك اوت شده را به داروي سيس پلاتين كه يكي از داروهاي موثر در شيمي درماني است مورد بررسي قرار داديم. مواد و روش¬ها: در مرحله ي اول رده هاي سلولي,T47D در محيط كشت كامل كشت داده شدند و استخراج RNA را با استفاده ازكيت ترايزول انجام و از آن cDNAتهيه شد .تشكيل شدن باند ژن HO-1 پس از PCR نشان دهنده ي بيان اين ژن در اين رده هاي سلولي بود.پس از آن كه از بيان ژنHo-1 اطمينان حاصل كرديم، ابتدا ازيك طرف بيان هم اكسي ژناز را از طريق القا كننده آن، افزايش داديم و از طرف ديگر براي ناك اوت اين ژن سازه هاي HDR plasmid و KOplasmid را با استفاده ازمحلول ترانسفكشن به رده هاي سلولي مذكور ترانسفكت كرديم و با استفاده از آنتي بيونيك پرومايسين سلول هايي كه در آن ها ترانسفكت به درستي انجام شده است و ژن HO-1 ناك اوت شده است را انتخاب كرديم.در مرحله ي بعد براي تاييد ناك اوت مجددا از روش RT- PCR استفاده شد. در اين مرحله تشكيل نشدن باند HO-1 در ژل آگارز تاييد كننده ي كار بود. در ادامه با استفاده از روش MTT assay ميزان تكثير سلول هاي تيمار شده با همين و سلولهاي ناك اوت شده را با سلول هاي كنترل مقايسه كرديم.پس از اين مرحله ميزان آپوپتوز در سلول هاي ناك اوت شده و تيمار شده را با استفاده از رنگ آميزي هوخست با سلول هاي كنترل مقايسه كرديم در مرحله ي بعد براي آن كه ميزان مهاجرت سلول هارا نسبت به سلول هاي كنترل بسنجيم از روش هاي Scratch و Transwell migration assay استفاده كرديم.در اخرين مرحله براي بررسي تغيير ميزان حساسيت سلول هاي القا و ناك اوت شده هم اكسيژناز به داروي سيس پلاتين، ابتدا دوز IC50 سيس پلاتين در سلول هاي T47D را تعيين كرديم .سپس ميزان حساسيت به سيس پلاتين را در سلول هاي سرطاني تيمار شده با همين و ناك اوت سنجيديم و آن را با گروه كنترل مقايسه كرديم. نتايج: يافته هاي ما نشان دادند كه ناك اوت ژن HO-1 باعث كاهش تكثير و مهاجرت و افزايش حساسيت به سيس پلاتين و افزايش اپوپتوز در رده ي سلولي سرطان سينه T47D شد و القاي اين ژن توسط همين باعث افزايش تكثير و مهاجرت و كاهش اپوپتوز و حساسيت به داروي سيس پلاتين در رده ي سلولي T47D شد. نتيجه¬گيري: به نظر مي رسد كه القاي بيان ژن HO-1 در رده ي سلولي T47D سرطان سينه باعث مقاوم شدن اين سلول ها نسبت به شيمي درماني و كاهش اپوپتوز سلول مي شود و از طرفي با تكثير اين سلول ها رابطه ي مستقيم دارد و سلول هارا تهاجمي تر مي كند بنابراين جلوگيري از بيان اين ژن در سرطان سينه مي تواند روشي اميدواركننده در درمان اين سرطان باشد. كليدواژه: CRISPER/Cas9 ، رده سلولي T47D ، آپوپتوز، تكثير سلولي، سيس پلاتين

215391

علوم پزشكي گيلان