توليد و مشخصه يابي شكل نوتركيب آنزيم ميتوكندريايي منگنز سوپراكسيد ديسموتاز (Mn-SOD) از گياه حرا (Avicennia marina)

اصفهان : دانشگاه صنعتي اصفهان

مهندسي كشاورزي

كارشناسي ارشد

سوپر اكسيد ديسموتاز يك آنزيم آنتي اكسيدان است كه از سلول‌هاي زنده در برابر اثرات مخرب آنيون سوپراكسيد محافظت مي‌كند. اين آنزيم با احيا آنيون سوپراكسيد، آن را به پراكسيد هيدروژن و اكسيژن مولكولي تبديل مي‌كند. با توجه به نوع يون فلزي موجود در جايگاه فعال اين آنزيم، سه نوع SOD در اندامك‌ها يا سيتوسل سلول‌هاي زنده حضور دارد. اين آنزيم منحصر به فرد در درمان بيماريهايي كه بر مبناي تنش اكسيداتيو ايجاد مي شوند به كار مي‌رود. همچنين از آن به عنوان آنزيم ضد التهاب در علم پزشكي استفاده مي‌شود. تا كنون تلاش‌هاي متنوعي براي بهبود كارايي و پايداري اين آنزيم انجام شده است. با توجه به اين كه گياهاني كه در شرايط تنش زندگي مي‌كنند، سيستم آنتي اكسيداني قوي دارند پس انتظار مي رود گياه حرا كه يك گياه تالابي است و در شرايط محيطي خاص مانند شوري، گرما، غرقابي به سر مي‌برد، داراي آنزيم‌هاي آنتي اكسيدان قوي باشد. هدف از اين تحقيق، بيان، تخليص و ميزان پايداري آنزيم در دما و pH هاي مختلف فعاليت آنزيم Mn-SOD از گياه حرا بود. بدين منظور ژن كد كننده Mn-SOD يك بار به صورت دست نخورده(MnSOD) و بار ديگر بدون توالي سيگنال ميتوكندريايي(tMnSOD) در وكتور بياني pET-28a(+) كلون شد و سپس اين پلاسميدهاي نوتركيب به باكتري اشرشيا كلي سويه Rosetta–DE3 منتقل شد. پس از مشاهده بيان پروتئين، اين آنزيم‌ها به دليل داشتن دنباله‌ي پلي هيستيدين توسط ستون كروماتوگرافي تمايلي بر پايه نيكل خالص سازي شدند. اگرچه پروتئين ها به خوبي بيان شدند ولي پروتئين MnSOD با وزن 29 كيلودالتون و طول 264 اسيدآمينه وارد فاز نامحلول شد و خالص سازي آن صورت نگرفت. در مقابل پروتئينtMnSOD با وزن 8/26 كيلودالتون و طول 243 اسيد آمينه پس از بيان وارد فاز محلول شد و به خوبي خالص شد. فعاليت اين آنزيم‌ با روش زانتين و زانتين اكسيداز سنجيده شد و تاثير افزودن يون فلزي موجود در جايگاه فعال آنزيم با افزودن اين يون به محيط كشت باكتري، در ميزان توليد پروتئين نوتركيب و فعاليت آنزيم ارزيابي شد. همچنين، پايداري آنزيم tMnSOD در بازه دمايي 25 تا 75 درجه سلسيوس و بازه pH 4 تا 12 سنجيده و با آنزيمCuZnSOD گياه حرا كه قبلا توليد و خالص سازي شده بود،مقايسه شد. سپس شرايط بهينه فعاليت اين آنزيم مورد بررسي قرار گرفت. افزودن يون‌ فلزي منگنز به محيط كشت باكتري باعث افزايش حلاليت پروتئين شد و فعاليت اين آنزيم را افزايش داد. فعاليت آنزيمي CuZnSOD و tMnSOD به ترتيب U/mg5962 و U/mg1600 ارزيابي شد كه نشان مي‌دهد فعاليت آنزيم CuZnSOD از فعاليت tMnSOD بسيار بالاتر مي‌باشد. دماي بهينه براي فعاليت آنزيم tMnSOD 37 و براي آنزيم CuZnSOD 50 درجه سلسيوس بود و هر دو آنزيم در 6 pH بهترين فعاليت خود را داشتند با اين حال پايداري آنزيم CuZnSOD از tMnSOD در شرايط مختلف بسيار بيشتر بود. نتايج حاصل از رسم نمودار باكتري نوتركيب حامل اين دو پروتئين نشان داد دو پروتئين مذكور در ايجاد مقاومت به شوري تاثيري مثبت دارند و تاثير tMnSOD بيشتر است.

211435

بيوتكنولوژي

مهندسي كشاورزي

دانشگاه صنعتي اصفهان

محمد هادي جزيني

ابوذر سورني، مسعود بهار

آذر شاه پيري